In diesem Museum sind Kunstwerke aus Kirchen der Stadt und aus dem übrigen Gebiet der Diözese von Florenz ausgestellt, die aus Sicherheitsgründen nicht an ihren jeweiligen ursprünglichen Standorten aufbewahrt werden können. Die Öffnung für Besucher im Jahre 1996 folgte auf die langwierigen Restaurationsarbeiten, die zur Wiederherstellung der Räume nach dem Attentat von 1993 in der Via dei Georgofili notwendig geworden waren; doch bereits seit mehr als 10 Jahren war in der Kirche das Magazin der Diözese mit Kunstwerken eingerichtet worden, zu dem nur Gelehrte Zugang hatten.

Mit dieser Maßnahme, die mit Hilfe des Beitrags der Region Toskana ermöglicht wurde, konnten die notwendigen Strukturen bereitgestellt werden, so daß mit der neuen Ausstattung nicht nur die Ausstellungsstücke aufgewertet wurden, sondern auch die Kirche selbst, die den beiden Heiligen Stefano und Cecilia geweiht ist und bereits im Jahre 1116 existierte, wobei ihre romanische Fassade zu verschiedenen Zeiten geschaffen wurde, ausgehend von dem unteren Bereich (1233). Der Innenraum, der im 17. Jh. von dem Architekten Ferdinando Tacca umgestaltet wurde, bewahrt heute unter anderem, vor dem Chorraum, eine effektvolle Freitreppe in der typisch manieristischen Eleganz, die von Bernanrdo Buontalenti (1574) entworfen wurde und aus der Kirche S. Trinita hierher verlegt wurde.

Das Museum erstreckt sich auf drei Etagen, von denen man auf den kleinen Kreuzgang mit seinem Renaissancebrunnen blickt, und auf den sich die Zellenfenster der Augustinermönche der Kongregation von Lecceto öffneten, die vom 16. bis 18. Jh. in Santo Stefano ihre Klosterniederlassung hatten.

Die Ausstellung legt besonderes Gewicht auf die absoluten Meisterwerke der italienischen Kunst, wie die Madonna von Giotto, die aus der Kirche San Giorgio alla Costa stammt, L’Adorazione dei Magi (Anbetung durch die hl. Drei Könige) von Paolo Uccello, San Giuliano von Masolino; doch auch eine vielfältige Auswahl wertvoller Gegenstände und Wandteppiche des liturgischen Gebrauchs werden hervorgehoben; in dieser reichhaltigen Typologie hat auch die Produktion mehrfarbiger Plastiken Platz, die sich durch ihren hohen expressiven Wert auszeichnen.